Clinical and diagnostic importance of the evaluation of the Ig proteases activity in children with intestinal dysbacteriosis
The specific activity of serine, metal dependent and thiolic Ig proteases in the coprofiltrates of children with manifestations of intestinal dysbacteriosis was determined by the enzyme immunoassay. 56 children with pronounced symptoms of intestinal disorders (37 children aged up to 1 year and 19 children over 1 year) were examined. A group of 25 clinically healthy children was used as control. Simultaneously with protease activity of coprofiltrates, there was detected the level of Ig-degrading activity of the opportunistic bacteria islolates of different taxonomic groups from feces of children with dysbacteriosis of different severity (as determined by the classical bacteriological method). The evaluation of the Ig-proteolytic activity of fecal supernatants, associated with the presence of serine, metal-dependent and thiolic proteases in the intestine, as well as detection of such proteases in microbial isolates, seems to be highly important for the diagnosis of intestinal disorders in children and is recommended for screening of intestinal dysbacteriosis.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2004, No. 3, P.73-77.
Актуальность диагностики и коррекции кишечных и внекишечных расстройств у детей, патогенетически связанных с дисбактериозом желудочно-кишечного тракта, в настоящее время очевидно [3]. Клинические проявления кишечных расстройств у детей не всегда коррелируют с результатами микробных карт при бактериологическом анализе фекалий на дисбактериоз кишечника. Применяемый в практике количественный бактериологический метод на дисбактериоз кишечника не дает полного представления о содержании различных представителей облигатно-анаэробной микрофлоры, играющих значимую роль в колонизационной резистентности (КР) кишечника [1].
В последнее время появились новые способы экспресс-диагностики патологии кишечника, основанные на определении протеолитической активности содержимого дистальных отделов кишечника. При кишечной патологии у детей, связанной с дисбиотическими нарушениями, выявляется более высокая протеолитическая активность ферментов в копрофильтратах, чем в норме [5,7]. Оценка протеолитической агрессии микробных ферментов кишечника представляется весьма важной при кишечных расстройствах у детей в качестве скрининговой диагностики дисбактериоза.
Многие представители анаэробной и аэробной микрофлоры кишечника, в том числе наиболее важная группа условнопатогенных микроорганизмов, способны секретировать внеклеточные протеазы, расщепляющие секреторные иммуноглобулины [2,7,8]. В предложенных методах скрининговой диагностики дисбактериозов определяют в основном казеинолитическую активность протеаз копрофильтратов, которая неполно характеризует Ig-протеазный потенциал бактерий толстой кишки.
Целью настоящего исследования является оценка диагностической значимости определения иммуноглобулин расщепляющей активности копрофильтратов детей при кишечных расстройствах, протекающих на фоне дисбактериоза кишечника.
Материалы и методы.
Обследовано 56 детей с выраженными симптомами кишечных расстройств, из них 37 человек дети первого года жизни, 19 детей старше года. Контрольную группу составили 25 клинически здоровых детей с эубиозом толстого кишечника. Диагностика кишечных расстройств и дисбактериоза основывалась на результатах объективного обследования, анамнестических данных и бактериологических исследований.
Протеолитическую активность ферментов копрофильтратов и изолятов условнопатогенных бактерий (УПБ), выделенных из испражнений детей, определяли с помощью оригинального метода, основанного на иммуноферментном анализе. В качестве субстрата для ферментативной реакции в работе использован фармакопейный препарат нормального иммуноглобулина человека, поскольку расщепление иммуноглобулина ферментами копрофильтратов более точно отражает IgG расщепляющий потенциал содержимого дистальных отделов кишечника. Реакцию протеолиза проводили в трис-HCl буфере (рН=7,85) в течение 1 часа при 37ºC, в полистироловом планшете.
Для определения активности протеаз по классам в реакционную смесь вносили растворы необратимых ингибиторов. Далее методом ИФА определяли концентрацию нерасщепленных антител в реакционной смеси [4]. Активность протеаз общую и по классам (сериновые, металлозависимые, тиоловые) в копрофильтратах выражали в количестве иммуноглобулина, расщепленного за 1 час при 37ºС, в пересчете на 1 г фекалий. Активность Ig-протеаз изолятов УПБ выражали в количестве антител, расщепленных за 1 час инкубации при 37ºС, в пересчете на 1 млрд. микробных тел.
Результаты
У 92% обследованных детей с симптомами кишечных расстройств бактериологическим методом был диагностирован дисбактериоз кишечника. У детей контрольной группы дисбактериоз кишечника не выявлен. Детей с дисфункцией кишечника мы разделили на 4 группы.
Первую группу составили дети, имевшие сниженные количества бифидумбактерий или лактобактерий (n=14).
Вторую группу - дети с увеличенным содержанием в кишечнике Escherichia coli с атипичными свойствами (n=16).
Третья группа включала детей, у которых выявляли в высоких концентрациях (107 -108 КОЕ/мл) ассоциации условнопатогенных микроорганизмов (n=16).
У детей этой группы выявлены следующие типы микробных ассоциаций: Enterobacter agglomerans + Proteus vulgaris, Enterobacter aerogenes + Staphylococcus epidermidis, Enterobacter agglomerans + Enterococcus spp., Citrobacter freundii + Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae + Proteus spp. + Candida spp., Proteus vulgaris + Candida spp., Proteus vulgaris + Staphylococcus spp., Enterococcus spp. + Staphylococcus spp. Четвертая группа - дети с массивным ростом бактерий рода Proteus (n=10).
Симптомы кишечных расстройств у больных детей были следующими: болевой абдоминальный синдромом (боли в около пупочной области), жидкий или водянистый стул с патологическими примесями (слизь, зелень), признаки лактазной недостаточности, запоры. Внекишечные проявления у детей, имеющих дисфункцию кишечника, в основном протекали с поражением кожи (опрелости, шелушение кожи, экзема).
У детей 2-й, 3-й, 4-й групп, среди симптомов кишечной дисфункции преобладали симптомы, характерные для воспалительного поражения сигмовидной и прямой кишки. Кишечная дисфункция в виде запоров, наиболее часто выявлялась у детей с высокой концентрацией атипичных вариантов эшерихий, или представителей рода Proteus. Сравнительные данные по активности Ig-протеаз в копрофильтратах больных и здоровых детей представлены в табл. 1.
При анализе анамнестических данных у больных детей выявлены такие факторы риска патологии кишечника, как частое применение антибиотиков (в 1-й группе в 57% случаев дети или их матери лечились антибиотиками широкого спектра действия, а в 4-й группе в 50% случаев) и раннее искусственное вскармливание. Из внекишечных проявлений у детей наибольшая частота кожных поражений выявлена в группе детей с дефицитом бифидо- и лактофлоры (1-я группа) и с высоким содержанием ассоциаций УПБ (Enterobacter spp., Proteus spp., K.pneumoniae, Staphylococcus spp.). У детей с экземой выявлен дефицит лакто - и бифидофлоры. При непереносимости грудного молока (лактазная недостаточность) у детей выявлен дефицит бифидо-и лактофлоры и массивный рост микробов рода Proteus.
Средние значения Ig-протеазной активности Escherichia coli, Staphylococcus aureus и представителей родов Proteus , Klebsiella, Enterobacter , Enterococcus, и доля протеазоположительных культур представлены в табл. 2.
При анализе Ig-расщепляющей активности копрофильтратов у детей c бактериологически подтвержденным дисбактериозом кишечника выявлены следующие особенности. В 100% проб копрофильтратов регистрировали активность сериновых и тиоловых Ig-протеаз. Средние показатели общей Ig-протеазной активности копрофильтратов у детей с кишечной дисфункцией на фоне дисбактериоза достоверно превышали аналогичные показатели у детей контрольной группы.
Закономерным было преобладание активности тиоловых протеаз, по сравнению с контрольной группой. Достоверно выше были средние значения общей протеолитической активности копрофильтратов у детей, колонизированных протеем (4-я группа), по сравнению с пациентами 1-й, 2-й и 3-й групп.
При оценке Ig-протеазного потенциала бактериальных изолятов кишечника детей с дисбактериозом установлено, что наибольшим протеолитическим потенциалом обладали изоляты K. pneumoniae, P. vulgaris и E. coli, продуцирующие α-гемолизин. Представители кокковой флоры кишечника - коагулазоположительные, гемолитически активные изоляты S. aureus и Enterococcus fecalis в 100% случаев проявляли протеазную активность, однако их Ig-протеиназный потенциал был в 2 раза ниже, чем у представителей семейства Enterobacteriaceae.
Обсуждение
Для многих представителей микрофлоры, колонизирующих слизистые открытых полостей организма человека, характерна способность секретировать протеолитические ферменты, расщепляющие иммуноглобулины [2, 8]. Протеазы, образуемые микрофлорой слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, обладают различной субстратной специфичностью.
При нарушении нормальной микрофлоры кишечника нередко наблюдается селекция клонов УПБ, которые обладают ферментами, ассоциированными с их патогенным потенциалом [6]. В последние годы особое внимание исследователей привлекают ферменты, обладающие функцией Ig-протеаз, которые способны деградировать секреторные и плазменные иммуноглобулины, компоненты комплемента, белки межклеточного матрикса, воздействующие на эндотелий сосудов, активирующие компоненты свертывающей системы крови и фибринолиза.
По-видимому, Ig-протеазы способны запускать и поддерживать воспалительные реакции в слизистой кишечника, снижать уровень специфической и неспецифической резистентности слизистых, приводя в конечном итоге к снижению колонизационной резистентности кишечника.
Многие из изученных микробных протеаз, входящие в состав "экзотоксиновых комплексов", продуцируются только протеазоположительными штаммами микроорганизмов, способными вызвать развитие инфекционного процесса. При комплексном воздействии ферментов патогенности, выделяемых протеазоположительными микроорганизмами кишечника, особенно в сочетании с энтеротоксинпродуцирующей активностью бактерий, заселяющих кишечник, создает условия для возникновения и поддержания воспалительного процесса и развития эндогенной инфекции.
Результаты наших исследований показали, что метод определения Ig-протеазной активности копрофильтратов может быть использован в скрининговой диагностике дисбактериоза кишечника, а также и для контроля эффективности проводимой терапии.
Таблица 3. Характеристика клинических проявлений и значения активности протеаз копрофильтратов у детей с дисбактериозом кишечника
Клинические проявления и протеолитическая активность кишечника
Группы детей.
1
2
3
4
Контрольная группа
Внекишечные:
атопический диатез
64%
19%
55%
55%
2%
экзема
11%
0
0
0
Нет
непереносимость молока
55%
23%
33%
33%
Нет
Кишечные синдромы:
болевой абдоминальный синдром
0
19%
0
0
Нет
неустойчивый, водянистый стул
77%
47,6%
78%
78%
Нет
патологические примеси в стуле
11%
0
11%
11%
Нет
запоры
0
9,5%
12%
12%
3%
Активность протеаз копрофильтратов
Общая
49,2±9,61**
45,2±8,8**
59±1,5*
62,8±2,16***
18,5±5,2 1),2),3),4)
р=0,0001
Сериновые
5,9±2
4,6±1,3
1,7±0,5*
5,0±2,3
6,2±2,13)
Металлзависимые
12±3,8****
7,2±2,8
2,2±0,17*
7,3±3
6,7±1,41)3)
р <0,001
Тиоловые
31,2±9,36
33,4±7,2
55,2±1,4
50,4±1,7
5,7±1,2 1)2)3)4)
p <0,00012)
Примечания:
1)2)3)4)- средние показатели активности контрольной группы достоверно различаются с значениями 1,2,3,4 групп
3) - средние показатели активности контрольной группы достоверно различаются со значением 3 группы
1)3)- средние показатели активности контрольной группы достоверно различаются со значениями 1,3 групп.
****различия с показателями 2,3, 4 и контрольной группой достоверны (р<0,05).
* различия с показателями 1,2,4 и контрольной группой достоверны (p<0,05)
*** различия с показателями 1,2,3 и контрольной группой достоверны (p<0,05)
** различия с показателями 4 и контрольной группой достоверны (p<0,05)