Пробиотики и механизмы их лечебного действия

Введение. Нарушениям нормальной микрофлоры подвержены громадные слои населения в нашей стране. Это жители экологически неблагоприятных регионов, рабочие вредных производств, микрофлора которых страдает из-за воздействий на организм физических, химических, радиационных и других факторов; также дети, особенно новорожденные и раннего возраста, школьники, подростки и студенты [1,3,5,6,10,11]. Известны микроэкологические нарушения у пациентов практически всех клиник и стационаров. Сложившаяся ситуация свидетельствует о крайней необходимости коррекции нарушенной нормальной микрофлоры, в первую очередь, желудочно-кишечного тракта.

В настоящем сообщении обобщены и проанализированы данные о механизме действия известных в настоящее время препаратов-пробиотиков на основе экстраполяции знаний о защитной роли отдельных представителей нормальной микрофлоры человека и наблюдений клиницистов и описаны предлагаемые различными исследователями критерии отбора потенциально производственных культур с целью совершенствования пробиотических препаратов.

Дисбактериоз кишечника. Нарушение нормальной микрофлоры кишечника детально отражено в Отраслевом Стандарте «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» [9], в материалах которого дисбактериоз кишечника рассматривается как клинико-лабораторный синдром, возникающий при ряде заболеваний и клинических ситуаций, характеризующийся изменением качественного и/или количественного состава нормальной микрофлоры, метаболическими и иммунными нарушениями, сопровождающимися у части больных клиническими проявлениями [9]. По данным многолетних клинических наблюдений за лечебным и профилактическим эффектом пробиотических препаратов показали, что они практически не обладают побочным действием даже при длительном их назначении больным с явлениями дисфункции желудочно-кишечного тракта.

В нашей стране производится довольно большое количество препаратов пробиотиков, созданных на основе бифидобактерий, лактобацилл, эшерихий, энтерококков, споровых аэробных и других микроорганизмов, приведенных в таблице [2]. Пробиотики – это живые микроорганизмы и вещества микробного происхождения, оказывающие при естественном способе введения позитивные эффекты на физиологические, биохимические и иммунные реакции организма хозяина через стабилизацию и оптимизацию функции его нормальной микрофлоры [1,9,11,13].

Перед клиницистом стоит задача подобрать пробиотик для той или иной клинической ситуации, учитывая при этом клинические проявления, характер основного заболевания, его фазу, тяжесть и показатели бактериологических исследований, позволяющих оценить степень и характер нарушений нормальной микрофлоры и определить чувствительность избыточной условнопатогенной микрофлоры к специфическим лечебным бактериофагам и лекарственным средствам.

Современным представлением механизма положительного действия пробиотиков является их многогранность, ассоциированная с подавлением патогенных и условнопатогенных микроорганизмов за счет продукции биологически активных веществ, конкуренции за лимитируемые нутриенты и сайты адгезии на кишечной стенке; влиянии на ферментативную активность желудочно-кишечного тракта и стимуляции иммунной системы организма хозяина [1,3,5,12,14,19].

Таблица. Препараты-пробиотики, зарегистрированные в РФ. 






Группы препаратов

Моно-
компонентные

Поли-
компонентные

Комбинированные,
сорбированные или микробные метаболиты


 
Бифидо-содержащие

Бифидумбактерин
в порошке (B. bifidum).
Бифидумбактерин сухой (B.bifidum).
 

Бификол сухой (B. bifidum и E. coli
M-17).
Линекс (B.infantis, L.acidophilus, E. faecium).
Бифиформ (В. longum и Enterococcus faecium).

 
Бифилиз сухой (B.bifidum и лизоцим).
Бифидумбактерин форте, пробифор
(B.bifidum, адсорбированные на активированном угле в дозах 5,0 x107 и 5,0 x108 м.к. соответственно)


 
Лакто-содержащие

Лактобактерин сухой (L.plantarum 8RA-3)
Биобактон сухой (L.acidophilus 12б).
Гастрофарм (L.bulgaricus LB-51).

Ацилакт сухой (L.acidophilus - 3 разных штамма).
 

Кипацид
(штаммы L.acidophilus,входящие в состав препарата ацилакт и лизоцим).
Аципол (L.acidophilus и полисахарид кефирных грибков).


 
Коли-содержащие

Колибактерин сухой (E.coli М-17),

Бификол сухой (B.bifidum и E. coli M-17).

Биофлор (E.coli М-17, выращенная на среде
с экстрактами из сои, овощей и прополиса).


 
Из других видов бактерий
 

Споробактерин
(B.subtilis ).
Бактиспорин
(B.subtilis ).
Бактисубтил (B.sereus).
Энтерол (Saccharomyces boulardii).

Биоспорин (B. subtilis и B.licheniformis).

Хилак-форте содержит, концентрат продуктов метаболизма L.acidophilus и L.helveticus, E. coli, Enterococcus faecalis, молочную, фосфорную и лимонную кислоты.

Наиболее важным свойством пробиотических бактерий является обеспечение колонизационной резистентности, т.е. способности защиты кишечной стенки от проникновения во внутреннюю среду организма как бактерий, так и токсинов и токсических продуктов различного происхождения [1,11,16-17,25].

В комплексе механизмов колонизационной резистентности важную роль играет антагонистическая активность пробиотической культуры, ее способность колонизировать слизистую, которая складывается из адгезии микроорганизмов к эпителиальным клеткам кишечника, конкуренции за рецепторы связывания и блокады адгезии и колонизации слизистых патогенными и условнопатогенными микробами с участием факторов как иммуноглобулиновой природы, так и неспецифических факторов зашиты организма хозяина [1,4,11,14,16,18,20,22,25].

Роль адгезинов у разных микроорганизмов выполняют поверхностно расположенные фимбрии, антигены белковой или полисахаридной природы, липотейхоевые кислоты, фосфолипиды и др.[3,14,22,25]. Процесс адгезии позволяет микробам удержаться в определенной нише, что обеспечивает возможность эффективной колонизации слизистой симбионтами.

Следовательно, одним из способов предотвращения колонизации кишечника патогеном является подавление его прикрепления путем насыщения эпителиальных рецепторов лигандами адгезии симбионтов. Известно, что предварительная обработка энтероцитов кишечника фимбиальным антигеном адгезии непатогенного штамма, например кишечной палочки, создает резистентность к инфицированию патогенными штаммами, обладающими этим же адгезином. Как показали исследования процесс адгезии лакто- и бифидобактерий к кишечному эпителию происходит за счет фимбиоподобных структур и компонентов клеточной стенки, по-видимому, белков наружной мембраны и липотейхоевой кислоты [3,11,12,22,25].

Антагонистическое действие пробиотических бактерий связано также с продукцией органических кислот, бактериоцинов и ингибиторных протеинов, в том числе, термолабильных и термостабильных высоко- и низкомолекулярных антибактериальных субстанций и антибиотиков. Органические кислоты являются конечными продуктами метаболизма, которые экскретируются в окружающую среду. Это молочная, уксусная, масляная, пропионовая, изомасляная, изовалериановая, муравьиная, сукциниловая, янтарная и др. кислоты. Антимикробный эффект молочной и уксусной кислот хорошо изучен. Кислоты проникают через мембрану, выделяют ион гидроокиси в нейтральную цитоплазму, что приводит к подавлению жизненных функций клетки. Так, уксусная кислота при рН выше 4,5 проявляет более выраженный ингибирующий эффект, чем молочная кислота, и, наоборот, при рН ниже 4,0 более сильная антимикробная активность наблюдается у молочной кислоты [3,13,16,22].

Положительное влияние бифидофлоры на физиологические функции организма детей и взрослых связывают с продукцией ею молочной и уксусной кислот, создающих в кишечнике кислую реакцию, которая препятствует размножению патогенной, гнилостной и газообразующей микрофлоры. К низкомолекулярным антибактериальным субстанциям относят перекись водорода и диацетил. Обе эти субстанции обладают антимикробной активностью по отношению к широкому кругу патогенных и условнопатогенных микроорганизмов.

Важную роль играют бактериоцины - биологически активные белковой природы. Известны два типа бактериоцинов: высокомолекулярные (1), подавляющие в основном близкородственные виды бактерий, обитающих в той же экологической нише, и низкомолекулярные вещества – микроцины (2), характеризующиеся широким спектром антагонистической активности. Способность выделять антибиотикоподобные субстанции хорошо изучены у бифидобактерий. Эти соединения – бифидин и бифилонг, достаточно стабильны при температуре 1000С, активны при кислой рН и проявляют антимикробную активность в отношении многих видов энтеробактерий, вибрионов, стрептококков и стафилококков [3,19]. Многие виды лактобактерий также выделяют специфические для них бактериоцины, характеризующиеся широким спектром антимикробной активности.

Известны лактоцины B,F,J,M, ацидолин и лактоцидин продуцируемые Lactobacillus acidophilus, булгарицин – L.delbrueсkii subsp. bulgaricus, лактобревин – L. brevis, гельветицин – L. helveticus, лактолин – L. plantarum, реутерин – L. reuteri. Эти бактериоцины ингибирут рост и размножение бацилл, клостридий, сахаромицетов, стрептококков, стафилококков, энтеробактерий, псевдомонад, листерий, грибов рода Candida [3,8,11,20,22].

Процессы детоксикации различных веществ и субстанций протекают с вовлечением нормальной микрофлоры в условиях анаэробиоза за счет гидролитических и восстановительных реакций. Процесс детоксикации с этом случае идет по нескольким направлениям: (1) биотрансформации с образованием нетоксических конечных продуктов; (2) микробной трансформации, сопровождающейся образованием метаболитов, подвергающихся быстрой деструкции в печени; (3) изменения полярности соединений таким образом, что изменяется скорость их экскреции в окружающую среду или транслокации из крови в просвет кишечника и мочевыделительную систему.

Нормальная микрофлора способна также инактивировать попадающие извне или образующиеся в организме разнообразные по химическому составу потенциальные токсические продукты, в том числе канцерогены [3,11,15,21-24]. Анаэробные бактерии разрушают более широкий спектр токсических поллютантов, а сами процессы детоксикации идут с большей эффективностью по сравнению с аэробным процессом, известным для факультативно-анаэробных и аэробных бактерий. Нормальная микрофлора кишечника является метаболическим органом, который вовлекается в трансформацию естественных и чужеродных субстанций.

Она является той структурой, на которой проходит первичная абсорбция, и через которую транслоцируются полезные и вредные агенты. Не отрицается и факт существования биопленки, выстилающей слизистые оболочки и включающей в себя многочисленные микроколонии различных бактерий, в регуляции синтеза которой участвует система “Quorum sensing” [22]. Описана также специфическая и неспецифическая инактивация антибиотиков и других химиопрепаратов. Так штаммы, резистентные к бета-лактамовым антибиотикам, продуцируют ферменты (бета-лактамазы), гидролизующие бета-лактамовое кольцо пенициллинов и цефалоспоринов.

Подобный характер инактивации антибиотиков отмечен в отношении многих аминогликозидных антибиотиков, хлорамфеникола и других. Инактивация химиопрепаратов может происходить не только за счет их ферментативного разрушения, но и в результате связывания бактериальными клетками. Значительная часть этих химиотерапевтических соединений после попадания в пищеварительный тракт связывается с микробными клетками и фекальным содержимым, что сопровождается потерей их антимикробной активности. Установлен детоксикационный эффект анаэробной нормофлоры, продуцирующей нитроредуктазу, в отношении 1-нитропирена и его метаболитов, являющихся мощными канцерогенами.

Известно также, что микроорганизмы кишечника осуществляют метаболизацию катехинов, детоксицируют соли тяжелых металлов за счет перевода их в нетоксические соединения, сорбцию токсических элементов на своей поверхности с последующей их элиминацией [3,8,11,25]. Избыточное поступление щавелевой кислоты, например, разрушается бифидобактериями, лактобактериями.
Данные литературы свидетельствуют об огромной роли нормальной микрофлоры кишечника как фактора неспецифической резистентности, который реализуется не только за счет микробного антагонизма, но и неспецифической активации фагоцитарной и цитостатической активности макрофагов, стимуляции лимфоидной ткани, воздействия на иммунокомпетентные Т- и В-клетки [1,3,8,11,20].

Вырабатывающиеся иммуноглобулины в кишечнике включаются в сложный механизм контроля кишечных микроорганизмов, в том числе и патогенных, осуществляемый путем блокирования прикрепления их к эпителию слизистой оболочки, нейтрализации путем аггглютинации, бактериостаза и других бактерицидных механизмов, с последующей их элиминацией из кишечника [1,3,8,11,17].
Предполагают, что секреторные иммуноглобулины выполняют важную роль в местном иммунитете кишечника: IgA-1 антитела за счет тяжелых цепей, имеющих химическое сродство с мукозой, обеспечивают формирование монослоя иммуноглобулинов на поверхности слизистой оболочки.

Иммуноглобулины субкласса IgA2, не имея родства со слизистой оболочкой, поступают в просвет кишечника и действуют как первое звено иммунной защиты, при этом лактобациллы и бифидобактерии в отличие от эшерихиозной микрофлоры, часто не покрываются иммуноглобулинами. Показано, что прием бифидумбактерина форте способствовал значительному увеличению относительного и абсолютного числа В-лимфоцитов при снижении относительного и абсолютного числа Т-лимфоцитов [7]. Важная роль микрофлоры в развитии иммунного ответа обусловлена ее универсальными иммуномодулирующими свойствами, включающими как иммуностимуляцию, так и иммуносупрессию [3,8,11,22,25]. Бактериальные липополисахариды и пептидогликаны, входящие в состав клеточной стенки различных видов нормофлоры, оказывают иммунорегулирующее действие [3,8,10-11].
Перспективы совершенствования пробиотиков.

Пробиотические препараты крайне необходимы как в острый период заболевания, так и в период реконвалесценции в связи с их способностью оказывать антагонистическое действие на возбудителей инфекции и стимулировать иммунорезистентность. Анализ данных литературы, свидетельствует о том, что бифидобактерии, составляющие с другими анаэробными бактериями основную часть нормофлоры при создании неблагоприятных условий исчезают из кишечника в первую очередь. Элиминация или значительное снижение их количества в желудочно-кишечном тракте ведут к глубоким, нарушениям процессов пищеварения и всех видов обмена. На фоне дефицита бифидофлоры наиболее активно проявляются патогенные свойства стафилококка, протеев, грибов рода Candida.

По мнению ряда исследователей [4,20] эффективный пробиотик должен быть: (1) непатогенным и нетоксичным; (2) оказывать положительный эффект на организм хозяина, например увеличивать противоинфекционную резистентность; (3) иметь в своем составе жизнеспособные клетки или продукты их метаболизма; (4) обладать способностью к выживанию и жизнедеятельности в условиях кишечного микроокружения, например, микроорганизм должен быть резистентен к низким значениям рН и органическим кислотам, к высокому содержанию желчи, солей натрия; (5) должен быть стабильным и сохранять жизнеспособные бактерии в течение длительного срока хранения.

К бактериям, на основе которых создаются пробиотики, должны отвечать следующим принципиальным требованиям: (1) предлагаемые для производства штаммы должны быть выделены от здоровых людей; (2) идентифицированы до вида по фено- и генотипическим признакам; (3) иметь генетический паспорт, (4) штаммы должны обладать широким спектром антагонистической активности в отношении патогенных и условнопатогенных микроорганизмов; (5) не должны угнетать нормальный микробиоценоз; (6) должны быть безопасны для людей, включая иммунологическую безопасность; (7) производственные штаммы должны быть стабильны по биологической активности и удовлетворять технологическим требованиям.

Лечебное действие препаратов зависит от стабильности их качества, сохранения полезных свойств на протяжении срока годности препарата. Стандартность качества препаратов в значительной мере связана со стандартностью производственных питательных сред.

Как нами отмечено выше, нормальная микрофлора открытых полостей организма человека представляет собой сложную поликомпонентную экосистему, каждый из сочленов которой составляет важное звено в обеспечении нормального микробиоценоза хозяина. Это определяет целесообразность конструирования поликомпонентных бакпрепаратов, включающих в свой состав индигенные бактерии с разным механизмом биологической активности, с целью расширения спектра их лечебного действия.

Недостаточно высокое качество пробиотических препаратов, содержащих жизнеспособные микробные клетки, часто бывает связано с нестандартностью их изготовления на всех этапах технологического процесса: культивирования, высушивания, дозирования герметизации, формы выпуска. Требуется оптимизация технологии культивирования производственных штаммов, позволяющая получать стандартные, полноценные по технологическим характеристикам препараты.

Перспективы совершенствования пробиотических препаратов заключается в изучении: (1) физиологии питания перспективных производственных штаммов с целью подбора питательных сред для их культивирования; (2)•процессов сорбции пробиотических бактерий, как общебиологического процесса; (3) выяснении роли продуктов метаболизма и биологически активных веществ микробной клетки для определения природы адгезинов, механизма антагонистической активности; (4) разработке технологии изготовления комплексных препаратов на основе консорциумов бактерий с широким спектром антагонистической активности; (5) изучение синергического и ингибиторного действия разных видов и штаммов пробиотических бактерий; (6) разработке оптимальной формы выпуска препаратов (порошок, таблетки с защитным покрытием, капсулы, гранулы, суппозитории, мази, гели и др.), обеспечивающей сохранение биологических свойств пробиотиков, простоту их применения; (7) совершенствовании методов контроля антагонистической активности препаратов, содержащих жизнеспособные микробные клетки и (8) разработке методов определения содержания живых микроорганизмов.

Одним из перспективных направлений является разработка новых поливалентных и комбинированных препаратов с иммобилизованными пробиотическими бактериями различных таксономических групп. Пока выпускаются только два сорбированных пробиотика бифидумбактерин форте и пробифор, представляющих собой высушенную микробную массу живых бифидобактерий, иммобилизованных на активированном угле. Механизм терапевтического действия этих препаратов отличается тем, что искусственно созданные сорбированные на частичках угля микроколонии бифидобактерий находятся в ином физико-химическом состоянии, что обеспечивает более интенсивное их взаимодействие с пристеночным слоем слизистой кишечника и заселение кишечника бифидобактериями, что существенно повышает их антагонистическую активность.

Объединение бифидобактерий в микроколонии обеспечивает также их высокую выживаемость при прохождении через кислую среду желудка, позволяет добиться высоких локальных концентраций на поверхности слизистой кишечника. Быстрое заселение кишечника бифидобактериями способствует нормализации количественного и качественного состава микрофлоры и стимулирует репаративный процесс слизистой оболочки кишечника.

Важной является задача по разработке препаратов для коррекции микрофлоры не только кишечника, но и других открытых полостей организма человека. Актуальной остается проблема уточнения лечебного действия каждого комплексного препарата-пробиотика с целью уточнения сферы его применения, а также безопасной схемы и дозы введения.

Литература

1.Бондаренко В.М., Воробьев А.А. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией. Журн. микробиол. 2004. № 1.С. 84-92.
2.Бондаренко В.М., Грачева Н.М. Препараты пробиотики, пребиотики и синбиотики в терапии и профилактике кишечных дисбактериозов. Фарматека. 2003.№ 7. С.56-63.
3.Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериозы кишечника у взрослых. КМК Scientific Press. Москва. 2003.С.224.
4.Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Воробьева М.А. Механизм действия пробиотических препаратов. БИОпрепараты. 2003. № 3. С. 2-5.
5.Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В., Воробьев А.А.. Микроэкологические изменения кишечника и их коррекция с помощью лечебно-профилактических препаратов. Журн. гастроэтерол. гепатол. колопроктол. 2003. № 4 (приложение № 20).С. 66-76.
6.Звягинцева Т.Д., Сергиенко Е.И. Дисбактериоз кишечника: клиническое значение и перспективы лечения. Эксперим. клин. гастроэнерол. 2003. № 3. С.70-74.
7.Лыкова Е.А., Мурашова А.О., Бондаренко В.М. и др. Нарушения микрофлоры кишечника и иммунитета у детей с аллергическими дерматитами и их коррекция. Росс. педиатр. журн. 2000. № 2. С. 20-24.
8.Онищенко Г.Г., Алешкин В.А., Афанасьев С.С. и др. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии. М.,2002.
9.Отраслевой Стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91500.11.0004-2003, утвержден Приказом Министерства здравоохранения РФ № 231 от 09.06.2003).
10 Парфенов А.И. Энтерология. Москва.2000.С.770.
11.Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Москва.2001.Том 3. С.288.
12.Berg R.D. The indigenous gastrointestinal microflora. Trends Microbiol.1996. № 4. P.430-435.
13.Collins M.D., Gibson G.R. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut. Am.J.Clin.Nutr.1999. Vol.69. № 5. Р.1052-1057.
14.Greene J.D., Klaenhammer T.R. Factors involved in adherence of lactobacilli to human Caco-2 cells. Appl.Envir.Microbiol.1994. Vol. 60. P.4487-4494.
15.Grill J.P., Crociani J., Ballongue J. Effect of bifidobacteria on nitrites and nitrosamines. Letts.Appl.Microbiol.1995.Vol. 20. P.328-330.
16.Holzapfel W.H., Haberer P.,Geisen R. et al. Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition.Am.J.Clin.Nutr.2001.Vol. 73(suppl). P.365-373.
17.Hunter J.O., Madden J.A. A review of the role of the gut microflora in irritable bowel syndrome and the effects of probiotics. Br.J.Nutr.2002. Vol. 88(suppl.1). P.67-72.
18.Lee Y.K., Lim C.Y., Teng W.L. et al. Quantitative approach in the study of adhesion of lactic acid bacteria to intestinal cells ant their competition with enterobacteria.Appl.Envir.Microbiol.2000.Vol., 66(9):3692-3697.
19.Lievin V., Peiffer I., Hudault S. et al. Bifidobacterium strains from resident infant human gastrointestinal microflora exert antimicrobial activity.Gut.2000. Vol.47. P.646-652.
20.O’Sullivan D.J. Screening of intestinal microflora for effective probiotic bacteria. J. Ag. Food Chem. 2001.Vol. 49. P.1751-1760.
21.Reddy B.S., Rivenson A. Inhibitory effect of Bifidobacterium longum on colon, mammary, and liver carcinogenesis induced by 2-amino-3-methylimidazo-4,5 quinoline, a food mutagen. Cancer Res. 1993. Vol. 53. P.3914-3918.
22.Schell M.A., Karmirantzou M., Snel B. et al. The genome sequence of Bifidobacterium longum reflect its adaptation to the human gastrointestinal tract. Proc.Natl.Sci.USA. 2002. Vol. 99. № 22. P.14422-14427.
23.Singh J.A., Rivenson M., Tomita M. et al. Bifidobacterium longum, a lactic acid-producing intestinal bacterium inhibits colon cancer and modulates the intermediate biomarkers of colon carcinogenesis. Carcinogenesis.1997.Vol. 18. P.833-841.
24.Sreekumar O., Hosono A. The antimutagenic of properties of a polysaccharide produced by Bifidobacterium longum and its cultured milk against some heterocyclic amines. Can. J. Microbiol.1998. Vol. 44. P.1029-1036.
25.Tannock G.W. Molecular assessment of intestinal microflora. Am.J.Clin.Nutr.2001. Vol. 73(suppl). P.410-414.

V.M. Bondarenko, R.P.Chuprynina, Z.I.Aladyscheva,T.V.Matzulevitz
Probiotics and mechanisms of their therapeutic effect

Gamaleya Research Institute for Epidemiology and Microbiology, Tarasevich State Control Institute, Moscow
Information about the probiotics used for the correction of resident normal colon microflora and mechanism of their positive therapeutic actions are presented. Probiotics are preparations containing live microbes or substances of microbial origin that, when introduced by natural methods are expected to confer beneficial physiologic, biochemical and immune effects to the host through the stabilization and the optimization of functions of normal microflora. Probiotics containing the Bifidobacterium, Lactobacillus, Escherichia, Enterococcus, Asporogenic aerobe Bacillus and Saccharomyces boulardii microorganisms are characterized.