6.3. Определение чувствительности P.aeruginosa Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. и других неферментирующих бактерий (НФБ).
При определении чувствительности НФБ следует иметь в виду, что ДДМ достаточно стандартизован лишь для P.aeruginosa и Acinetobacter spp. При исследовании Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas spp. (кроме P.aeruginosa) и других НФБ, предпочтение следует отдавать методам серийных разведений. Примерный перечень АБП, рекомендуемых для определения чувствительности рассматриваемой группы бактерий приведен в таблице 12.
Препараты первого ряда.
В первую очередь для оценки антибиотикочувствительности Pseudomonas spp. и Acinetobacter spp. следует использовать препараты, отличающиеся наибольшей природной активностью. К ним относятся:
Цефтазидим. Является одним из основных АБП, используемых для лечения инфекций, вызываемых рассматриваемой группой микроорганизмов.
Цефепим. При сопоставимом с цефтазидимом уровне природной активности, в ряде случаев цефепим сохраняет активность в отношении микроорганизмов, устойчивых к цефтазидиму.
Гентамицин, амикацин. Аминогликозиды для монотерапии инфекций, вызываемых рассматриваемой группой бактерий не применяются, однако во многих случаях являются необходимым компонентом комбинированных схем терапии. Целесообразность включения в перечень препаратов первого ряда амикацина и гентамицина обосновывается высокой частотой устойчивости к последнему антибиотику в ряде учреждений.
Ципрофлоксацин. Среди фторхинолонов ципрофлоксацин является препаратом выбора при лечении рассматриваемой группы инфекций.
Меропенем, имипенем. Меропенем характеризуются наибольшим уровнем активности в отношении рассматриваемой группы микроорганизмов, имипенем ему несколько уступает. Целесообразность включения обоих карбапенемов объясняется отсутствием между ними в некоторых случаях перекрестной резистентности.
Дополнительные препараты.
Дополнительные препараты по уровню природной активности, как правило, уступают антибиотикам первого ряда, однако во многих случаях, прежде всего, по экономическим соображениям могут быть использованы в терапии. Кроме этого необходимо учитывать, что неферментирующие бактерии существенно различаются по уровню природной чувствительности к АБП.
Азтреонам, цефоперазон. По основным свойствам близки к цефтазидиму.
Цефоперазон/сульбактам, тикарциллин/клавуланат, Доступные ингибиторы не способны подавлять активность большинства бета-лактамаз распространенным среди P. aeruginosa и, в силу этого комбинированные препараты, не обладают существенными преимуществами с сравнении с исходными антибиотиками.
Цефоперазон/сульбактам (а также ампициллин/сульбактам) могут иметь реальное значение в лечении инфекций, вызываемых Acinetobacter spp. благодаря наличию у сульбактама собственной активности в отношении указанного микроорганизма.
При инфекциях вызываемых Stenotrophomonas maltophilia клиническое значение имеет ко-тримоксазол и тикарциллин/клавуланат. Микроорганизм обладает природной устойчивостью ко всем бета-лактамам кроме (тикарциллина/клавуланата)
Карбенициллин. В силу выраженной токсичности и высокой частоты устойчивости применение карбенициллина даже для лечения инфекций, вызываемых P. aeruginosa следует признать нецелесообразным.
Очевидно, что «неферментирующие» микроорганизмы нельзя рассматривать как единую группу с точки зрения их природной чувствительности к антибиотикам. Оценка антибиотикочувствительности редких видов «неферментирующих» микроорганизмов требует индивидуального подхода.
Поскольку тяжелые инфекции, вызываемые псевдомонадами, являются показанием для назначения комбинированной терапии, целесообразно при выдаче ответа в клинику указывать на наиболее эффективную с микробиологической точки зрения комбинацию антибиотиков.
Пограничные значения МПК антибиотиков (и соответствующие диаметры зон ингибиции роста) в отношении Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. и неферментирующих бактерий, используемые для интерпретации результатов оценки антибиотикочувствительности приведены в таблице 4.
6.4. Определение чувствительности Staphylococcus spp.
При оценке чувствительности Staphylococcus spp. в первую очередь необходимо тестировать препараты, имеющие основное клиническое значение: бета-лактамы, макролиды, фторхинолоны, аминогликозиды и ванкомицин.
Критерии интерпретации результатов определения чувствительности Staphylococcus spp. (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 5.
Бета-лактамы. Препаратами выбора для лечения стафилококковых инфекций (вызванных как Staphylococcus aureus, так и коагулазонегативными стафилококками) являются бета-лактамные антибиотики, следовательно, в первую очередь необходимо определять чувствительность стафилококков к этим препаратам.
Устойчивость стафилококков к бета-лактамным АБП связана либо с продукцией бета-лактамаз, либо с наличием дополнительного пенициллино-связывающего белка - ПСБ2а. Выявление и дифференцировка этих двух механизмов резистентности позволяет надежно прогнозировать активность всех бета-лактамных антибиотиков без непосредственной оценки чувствительности к каждому из этих препаратов. При этом необходимо учитывать следующие закономерности:
- штаммы Staphylococcus spp., лишенные механизмов резистентности, чувствительны ко всем бета-лактамным АБП;
- бета-лактамазы (пенициллиназы) Staphylococcus spp. способны гидролизовать природные и полусинтетические пенициллины, за исключением оксациллина и метициллина. Чувствительность или резистентность к бензилпенициллину является индикатором активности природных и полусинтетических амино-, карбокси- и уреидопенициллинов. Остальные бета-лактамы с потенциальной антистафилококковой активностью (антистафилококковые пенициллины, цефалоспорины I, II и IV поколений и карбапенемы) сохраняют активность в отношении бета-лактамазпродуцирующих штаммов;
- штаммы Staphylococcus spp, обладающие ПСБ2а, клинически устойчивы ко всем бета-лактамным АБП. Маркером наличия ПСБ2а является устойчивость к оксациллину и метициллину. Такие штаммы исторически получили название метициллинорезистентных стафилококков.
Метициллин в настоящее время в клинической практике и в лабораторной диагностике не применяется, его практически полностью вытеснил оксациллин, соответственно появился термин «оксациллинорезистентность», являющийся полным синонимом термина «метициллинорезистентность».
Таким образом, определение чувствительности Staphylococcus spp. к бета-лактамным АБП должно включать выполнение двух тестов:
- определения чувствительности к бензилпенициллину или выявления продукции бета-лактамаз (пенициллиназ);
- определения чувствительности к оксациллину или выявления ПСБ2а или кодирующего его гена mecA.
Определение чувствительности к бензилпенициллину или выявление продукции бета-лактамаз (пенициллиназ).
Определение чувствительности Staphylococcus spp. к бензилпенициллину несколько затруднено тем фактом, что синтез бета-лактамаз у этого микроорганизма является индуцибельным процессом (продукция фермента усиливается после контакта с антибиотиком). В результате этого при использовании стандартных методов серийных разведений и ДДМ возможно получение результатов ложной чувствительности.
Решением данной проблемы может быть использование метода непосредственного выявления бета-лактамаз, основанного на использовании дисков с нитроцефином. Нитроцефин представляет собой хромогенный цефалоспорин, который легко гидролизуется под действием всех бета-лактамаз с образованием окрашенного продукта.
Постановка теста.
Для проведения исследования используют чашку, на которой оценивали чувствительноcть исследуемого штамма Staphylococcus spp. к пенициллину и/или оксациллину ДДМ. С границы зоны ингибиции роста вокруг диска с оксациллином бактериологической петлей забирается незначительное количество культуры и наносится на предварительно увлажненный диск с нитроцефином. Диск инкубируют при комнатной температуре до 1 ч.
Интерпретация результатов.
Появление красного окрашивания свидетельствует о продукции бета-лактамаз исследуемым штаммом микроорганизма.
Штамм, продуцирующий бета-лактамазу, рассматривают как устойчивый к природным и полусинтетическим пенициллинам (за исключением оксациллина), независимо от конкретных результатов тестирования к перечисленным АБП.
Определение чувствительности к оксациллину.
При определении чувствительности к оксациллину стандартными методами необходимо учитывать некоторые особенности:
- для приготовления инокулюма используют только прямой метод суспендирования колоний;
- длительность инкубации до момента учета результатов определения чувствительности к оксациллину должна составлять не менее 24 ч.
Особенности тестирования ДДМ:
- необходимо использовать диски, содержащие 1 мкг оксациллина;
- при учете результатов необходимо обращать внимание даже на единичные мелкие колонии стафилококков, обнаруженные в пределах зоны подавления роста.
Особенности тестировании методами серийных разведений.
В питательную среду целесообразно добавлять NaCl (до конечной концентрации 2%).
Интерпретация результатов тестирования стафилококков к оксациллину.
Штаммы стафилококков, резистентные к оксациллину, должны рассматриваться как устойчивые ко ВСЕМ бета-лактамным АБП.
Результаты определения чувствительности стафилококков к оксациллину и к другим бета-лактамным АБП могут быть противоречивыми, при этом результаты определения чувствительности к оксациллину являются решающими.
Определять чувствительность стафилококков к бета-лактамным АБП, кроме бензилпенициллина и оксациллина, нецелесообразно
Для метициллинорезистентных стафилококков характерно наличие ассоциированной резистентности к АБП других групп. Выявление у стафилококков множественной резистентности при чувствительности к оксациллину требует проведения повторных исследований.
Следует обратить внимание на различия в критериях метициллинорезистентности для S. aureus и коагулазонегативных стафилококков.
При получении сомнительных результатов необходимо использовать дополнительные методы (скрининг на агаре – метод приведен ниже, прямое выявление гена mecA или белка ПСБ2а).
Выдача клиницистам результатов исследования и рекомендаций по лечению.
При выделении пенициилино- и метициллино-чувствительных штаммов стафилококков, микроорганизм считается чувствительным ко всем бета-лактамным АБП, а препаратами выбора будут природные и аминопенициллины
При выявлении продукции бета-лактамаз и чувствительности к оксациллину, микроорганизм является резистентным к природным пенициллинам, амино-, карбокси- и уреидо- пенициллинам, но чувствителен к оксациллину, ингибиторозащищенным пенициллинам и цефалоспоринам I-II поколений, которые являются препаратами выбора в данном случае. В отношении данных штаммов будут также активны цефалоспорины IV поколения и карбапенемы, однако преимуществами в сравнении с препаратами выбора они не обладают.
При выявлении метициллинорезистентности штамм считается устойчивым ко ВСЕМ бета-лактамным антибиотикам, для лечения необходимо использовать препараты других групп, из которых препаратами выбора считаются гликопептиды.
Дополнительные методы выявления метициллинорезистентности.
Наиболее надежным методом выявления метициллинорезистентнсти у стафилококков является непосредственное определение наличия гена mecA молекулярно-генетическими методами (с помощью полимеразной цепной реакции - ПЦР). Кроме того, разработан коммерческий метод выявления дополнительного пенициллиносвязывающего белка – ПСБ2а в реакции агглютинации.
В то же время скрининг на агаре для выявления метициллинорезистентности является высоко чувствительным и специфичным методом, легко выполнимым в условиях рутинной работы микробиологической лаборатории, однако он может быть использован только для штаммов S. aureus.
Постановка теста.
Для проведения скрининга готовят чашки с агаром Мюллера-Хинтон, содержащие 4% NaCl и 6,0 мкг/мл оксациллина. Хлористый натрий вносят в питательную среду в необходимом количестве до автоклавирования. Рабочий раствор оксациллина добавляют в питательную среду после автоклавирования и охлаждения среды до 450– 500С. Для приготовления рабочего раствора оксациллина используют субстанцию АБП с известной активностью.
Микробную взвесь следует готовить ТОЛЬКО методом прямого суспендирования из нескольких однотипных изолированных колоний стафилококка, выросших на чашке с неселективным питательным агаром, в стерильном физиологическом растворе и доводят до мутности 0,5 по Мак-Фарланду (1,5·108 КОЕ/мл).
Инокуляция.
Для инокуляции чашек с агаром можно использовать два метода: 1) с помощью микропипетки или 2) с помощью стерильного ватного тампона.
1) Метод I (микропипеткой):
а) готовят разведение разведение 1:100 стандартного инокулюма, соответствующего стандарту мутности 0,5 по Мак-Фарланду для получения бактериальной взвеси, содержащей 1,5·106 КОЕ/мл (например, добавить 0,1 мл стандартной суспензии к 9,9 мл стерильного физиологического раствора);
б) с помощью микропипетки наносят каплю (10 мкл) разведенной стандартной суспензии на поверхность агара с оксациллином
2) Метод II (с помощью тампона):
а) стерильный ватный тампон погружают в пробирку со стандартизированной суспензией (0,5 по Мак-Фарланду), затем отжимают избыток влаги о стенку пробирки;
б) культуру наносят тампоном либо на ограниченную поверхность (диаметром 10-15 мм), либо на всю поверхность агара с оксациллином в чашке Петри.
Инкубация.
Штаммы S.aureus инкубируются при температуре 35°С в течение полных 24 ч, а коагулазанегативных стафилококков – в течение 48 ч.
Учет результатов.
После инкубации чашки тщательно просматривают в проходящем свете:
- появление видимого роста более 1 колонии или вуалеобразного роста на месте нанесения культуры означает устойчивость данного штамма к оксациллину (метициллину);
- при отсутствии роста на месте нанесения культуры исследуемый штамм учитывается как чувствительный к метициллину (оксациллину);
- при сомнительных результатах, а также для штаммов, выделенных у больных
с клинически неэффективной терапией и у больных с серьезными инфекциями, необходимо провести развернутое исследование с определением МПК к оксациллину и гена mecA.
Контроль качества.
Исследование проводят при обязательном контроле роста испытуемых культур на агаре Мюллера–Хинтон с 4% NaCl без оксациллина (культуру наносят так же, как на агар с оксациллином).
Параллельно с исследуемыми тестируют также контрольные штаммы метициллинчувствительных и метициллинрезистетных стафилококков:
Макролиды и линкозамиды. Макролиды и линкозамиды являются альтернативными препаратами для лечения стафилококковых инфекций. В исследование необходимо включать:
- один из представителей 14-ти и 15-членных макролидов. Полная перекрестная резистентность между отдельными представителями;
- клиндамицин. Полная перекрестная резистентность между 16-членными макролидами и линкозамидами.
Приведенный выбор препаратов определяется закономерностями перекрестной резистентности между антибиотиками указанных подгрупп.
Фторированные хинолоны. В последнее время отмечается повышение интереса к фторхинолонам как к препаратам для лечения стафилококковых инфекций (особенно кожи и мягких тканей). Новые представители этой группы АБП (антипневмококковые фторхинолоны – левофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин и др.) обладают повышенной активностью в отношении Staphylococcus spp., в сравнении с традиционными препаратами. Между перечисленными подгруппами препаратов нет полной перекрестной резистентности. Антипневмококковые препараты часто сохраняют активность в отношении штаммов, устойчивых другим фторхинолонам.
Аминогликозиды. На практике необходимо учитывать некоторые особенности интерпретации результатов, полученных in vitro, так при детекции устойчивости к гентамицину выделенный штамм следует рассматривать как устойчивый ко всем аминогликозидам. В этой связи гентамицин должен включаться в набор для тестирования в обязательном порядке. В тоже время крайне редко могут встречаться штаммы, устойчивые к другим аминогликозидам при чувствительности к гентамицину.
Ванкомицин. Ванкомицин является одним из препаратов выбора (наряду с оксазолидинонами) для лечения инфекций, вызываемых оксациллинрезистентными штаммами. Появление сообщений об устойчивости стафилококков к гликопептидам требует внимательного отношения к оценке результатов исследования
Дополнительные препараты.
Линезолид. Оксазолидиноны являются важным достижением в лечении инфекций, вызываемых оксациллинрезистентными штаммами, в том числе и устойчивыми к гликопептидам. В то же время необходимо иметь ввиду, что уже известно о формировании устойчивости к антибиотикам этой группы.
Другие препараты.
Ко-тримоксазол.
Хлорамфеникол.
Фузидиевая кислота.
Тетрациклины.
Рифампицин.
Значение перечисленных препаратов в лечении стафилококковых инфекций, вызванных метициллинчувствительными штаммами, невелико, так они уступают по активности бета-лактамам. Их клиническая эффективность при инфекциях вызываемых оксациллинрезистентными штаммами изучена недостаточно.
Рифампицин, ко-тримоксазол и фузидиевую кислоту нельзя рекомендовать как средство монотерапии из-за высокой частоты селекции резистентности в процессе лечения.
Формировать конкретный набор антибиотиков для оценки антибиотикочувствительности стафилококков наиболее целесообразно на основании данных о частоте распространения в стационаре метициллинрезистентности. При отсутствии или низкой частоте метициллинрезистентности вполне достаточно ограничиться оценкой чувствительности к оксациллину (в плане надзора), макролидам и, возможно, еще к 1-2 препаратам реально применяемым в конкретном стационаре для лечения стафилококковых инфекций. В случае же высокой частоты распространения метициллинрезистентности в исследование необходимо включать достаточно широкий круг антибиотиков.
6.5. Определение чувствительности Enterococcus spp.
Энтерококки характеризуются природной устойчивостью ко многим АБП (цефалоспоринам, аминогликозидам), а клиническое значение наблюдаемой in vitro чувствительности к тетрациклинам, хлорамфениколу, макролидам и рифампицину окончательно не определено. Таким образом, перечень препаратов, подлежащих включению в исследование энтерококков, весьма ограничен (таблица 17).
При решении вопроса о необходимости определения чувствительности Enterococcus spp. к АБП крайне важно оценить клиническую значимость этих микроорганизмов. Так, энтерококки, выделенные из нестерильных локусов организма, особенно в составе ассоциаций, чаще всего следует рассматривать как контаминирующие или колонизирующие микроорганизмы, соответственно, определять чувствительность таких штаммов к АБП нецелесообразно. Проводить определение чувствительности необходимо для штаммов Enterococcus spp., выделенных из крови и других в норме стерильных жидкостей и тканей организма, а также из мочи. При этом подходы к определению чувствительности этих микроорганизмов и наборы АБП для тестирования несколько различаются в зависимости от источника выделения штаммов (таблица 17).
Пенициллин и ампициллин. Данные антибиотики являются препаратами выбора для лечения энтерококковых инфекций. Между пенициллином и ампициллином отмечается перекрестная резистентность. Полученные результаты можно экстраполировать на ингибиторо-защищенные аминопенициллины и уреидопенициллины. Поскольку известны случаи резистентности энтерококков к пенициллинам, связанные с продукцией бета-лактамаз, резистентные штаммы следует исследовать на продукцию пенициллиназы в тесте с нитроцефином.
Аминогликозиды. Несмотря на то, что энтерококки обладают природной устойчивостью к аминогликозидам, данный класс АБП широко применяются в комбинированной терапии генерализованных энтерококковых инфекций. Целесообразность таких схем лечения объясняется выраженным синергизмом между аминогликозидами и ампициллином или ванкомицином. Однако синергизм проявляется только в том случае, если МПК аминогликозидов не превосходит 500 мкг/мл для гентамицина и 1000 мкг/мл для стрептомицина. Указанное обстоятельство требует проведения скрининга (методом серийных разведений или ДДМ) на наличие у энтерококков высокого уровня резистентности к стрептомицину и гентамицину.
Ванкомицин. Ванкомицин является препаратом выбора для лечения инфекций, вызванных штаммами, резистентными к бета-лактамам и аминогликозидам. В ряде географических регионов устойчивость энтерококков к ванкомицину является серьезной клинической проблемой. Имеются сообщения о выделении единичных штаммов ванкомицинорезистентных энтерококков и в России. Для выявления устойчивости энтерококков к ванкомицину целесообразно проводить целенаправленный скрининг.
Линезолид. Препарат является средством выбора для лечения инфекций штаммами, устойчивыми к ванкомицину. Линезолид также рассматривается в качестве альтернативы ванкомицину при лечении инфекций, вызываемых штаммами, устойчивыми к бета-лактамам и аминогликозидам.
Другие препараты.
В отношении ванкомицинрезистентных энтерококков, несмотря на отсутствие убедительных данных, возможно оценивать активность к тетрациклинов, хлорамфеникола, эритромицина и рифампина.
Для штаммов энтерококков, выделенных при инфекциях мочевыводящих путей, целесообразно исследовать чувствительность к следующим антибиотикам:
- пенициллину или ампициллину;
- фторхинолонам ;
- тетрациклинам;
- нитрофуранам;
- фосфомицину.
Критерии интерпретации результатов определения чувствительности
Enterococcus spp. (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 6.
Скрининг для выявления высокого уровня резистентности к аминогликозидам у энтерококков.
Скрининг можно проводить в агаре или бульоне.
Питательная среда.
Агар или бульон на сердечно-мозговом экстракте. Питательная среда готовится в соответствии с инструкцией производителя. После автоклавирования и охлаждения до 450–500С в среду асептически добавляют растворы антибиотиков до следующих конечных концентраций:
- гентамицин для скрининга в агаре и бульоне: 500 мг/л;
- стрептомицин:
- для скрининга в агаре: 2000 мг/л;
- для скрининга в бульоне: 1000 мг/л.
Приготовление микробной взвеси, инокуляция и инкубация.
Микробную взвесь готовят путем суспендирования изолированных колоний из 24-часовой культуры, выращенной на неселективных средах до концентрации 0,5 по Мак-Фарланду. Для скрининга на агаре на поверхность среды наносят 10,0 мкл суспензии. Для скрининга в бульоне в среду вносят инокулюм до конечной концентрации 5х105 КОЕ/мл. Инкубацию проводят при температуре 350С, для гентамицина – в течение полных 24 ч, для стрептомицина – до 48 ч.
Учет результатов.
Исследуемый штамм рассматривается как резистентный при следующих условиях:
- при скрининге на агаре – рост более 1 колонии;
- при скрининге в бульоне – любой видимый рост.
Контроль качества.
Для контроля качества используют штаммы чувствительных и резистентных энтерококков
Скрининг для выявления ванкомицинорезистентности у энтерококков.
Скрининг осуществляется на агаре.
Питательная среда.
Агар на сердечно-мозговом экстракте. Питательная среда готовится в соответствии с инструкцией производителя. После автоклавирования и охлаждения до 450–500С в среду асептически добавляют раствор ванкомицина до конечной концентрации 6,0 мг/л..
Приготовление микробной взвеси, инокуляция и инкубация.
Микробную взвесь готовят путем суспендирования изолированных колоний из 24-часовой культуры, выращенной на неселективных средах до концентрации 0,5 по Мак-Фарланду. Для скрининга на поверхность агара наносят 10,0 мкл суспензии. Инкубацию проводят при температуре 350С в течение полных 24 ч.
Учет результатов.
Исследуемый штамм рассматривается как резистентный при росте более 1 колонии на агаре с ванкомицином.
Контроль качества
Для контроля качества используют штаммы чувствительных и резистентных энтерококков
6.6. Определение чувствительности микроорганизмов со сложными питательными потребностями.
Определение чувствительности микроорганизмов со сложными питательными потребностями является методически одной из наиболее трудных задач, так как в ряде случаев требует одновременного использования метода серийных разведений и ДДМ, особой тщательности в выполнении всех процедур, начиная от приготовления питательных сред и инокулюма и заканчивая проведением контроля качества. В то же время эффективность эмпирической антибактериальной терапии многих инфекций, вызываемых микроорганизмами этой группы, хорошо предсказуема. Учитывая эти факты при оценке необходимости определения чувствительности микроорганизмов этой группы к АБП необходимо объективно оценить соотношение стоимости и эффективности (клинической значимости) таких исследований, а также сопоставить стоимость полноценного материально-технического оснащения с доступными ресурсами.
Попытки даже незначительной модификации стандартных методов (замена дорогостоящих реагентов на более дешевые) могут привести к получению ошибочных, недостоверных результатов, способных ввести в заблуждение и микробиологов, и клиницистов.
6.7. Определение чувствительности Streptococcus spp.
Питательные среды.
Для определения чувствительности стрептококков используют следующие питательные среды:
- для методов серийных разведений в бульоне необходимо использовать бульон Мюллера-Хинтон с добавлением 2,0 – 5,0% лизированной лошадиной крови. Кровь лизируют замораживанием - оттаиванием с последующим центрифугированием для освобождения от теней эритроцитов.
- для методов серийных разведений в агаре и ДДМ используют агар Мюллера-Хинтон с добавлением 5% дефибринированной бараньей крови.
Указанные добавки асептически вносят в питательную основу после автоклавирования и охлаждения до 48 – 500С.
Определение чувствительности Streptococcus pneumoniae.
Бета-лактамные антибиотики (в частности пенициллин) являются препаратами выбора для терапии пневмококковых инфекций. В то же время критерии интерпретации результатов определения чувствительности пневмококков к этим препаратам постоянно пересматриваются в связи с появлением новых клинических и экспериментальных данных об эффективности различных бета-лактамов при пневмококковых инфекциях, вызванных штаммами с различным уровнем чувствительности к пенициллину.
Механизм резистентности S.pneumoniae к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам обусловлен изменением пенициллиносвязывающих белков (ПСБ) клеточной стенки. В результате ступенчатых мутаций уменьшается сродство ПСБ к бета-лактамным антибиотикам.
При этом установлено, что при лечении инфекций дыхательных путей, вызванных штаммами S. pneumoniae с промежуточным уровнем резистентности к пенициллину, бета-лактамные антибиотики остаются клинически эффективными, но применение их при менингите приводит к неудаче терапии.
В связи с этим при разработке критериев интерпретации результатов определения чувствительности S.pneumoniae к бета-лактамным антибиотикам было проведено подразделение штаммов по источникам выделения (инфекции дыхательных путей, ликвор) и пересмотрены критерии оценки чувствительности к амоксициллину, цефотаксиму и цефтриаксону. Критерии интерпретации результатов определения чувствительности к пенициллину не пересмотрены.
Следует обратить внимание на несколько важных особенностей определения чувствительности S. pneumoniae:
- невозможность определения чувствительности к бета-лактамным антибиотикам (пенициллину, аминопенициллинам, цефалоспоринам, карбапенемам) ДДМ;
- невозможность определения чувствительности S. pneumoniae к АБП методом разведений в агаре
Поэтому определение чувствительности пневмококков к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам подразумевает последовательное (выделение S. pneumoniae из нестерильных локусов) или одновременное (при тяжелых инфекциях, выделении пневмококков из крови и ликвора) выполнение двух исследований:
- скрининга с диском, содержащим 1,0 мкг оксациллина, с целью выявления возможной пенициллинорезистентности. Скрининговый метод позволяет разделить микроорганизмы на две группы: группу чувствительных штаммов и группу, в которую входят часть чувствительных, а также умеренно-резистентные и резистентные штаммы пневмококков.
- определение МПК пенициллина и других бета-лактамных антибиотиков методом разведений в бульоне или с помощью Е-тестов у штаммов, отнесенных ко второй группе по результатам скрининга.
Скрининг на наличие пенициллинорезистентности у штаммов S.pneumoniae.
Постановка теста.
Методика проведения исследования не отличается от обычной процедуры определения чувствительности пневмококков к АБП ДДМ.
Интерпретация результатов.
При выявлении диаметра зоны подавления роста штамма пневмококка вокруг диска
с 1 мкг оксациллина >20 мм, S.pneumoniae расценивается как чувствительный ко всем бета-лактамным антибиотикам.
При выявлении диаметра зоны подавления роста <20 мм необходимо определение МПК всех бета-лактамных антибиотиков (пенициллина, аминопенициллинов, цефалоспоринов II-IV поколенй, карбапенемов) методами серийных разведений в бульоне или с помощью Е-тестов.
Макролиды и линкозамиды. Вторыми по значимости в лечении пневмококковых инфекций являются макролидные и линкозамидные антибиотики. Оценка чувствительности S. pneumoniae к перечисленным антибиотикам возможна как диско-диффузионным методом, так и методом серийных разведений. В связи с разнообразием механизмов устойчивости S. pneumoniae к макролидам в повседневной практике могут встречаться различные варианты перекрестной резистнетности микроорганизмов к АБП этой группы.
Однако в практических целях для характеристики чувствительности S. pneumoniae к рассматриваемой группе АБП достаточно оценить чувствительность к эритромицину и клиндамицину, что позволяет дифференцировать два основных фенотипа:
MLSB – перекрестная устойчивость ко всем макролидам, линкозамидам и стрептограминам В, обусловленная метилированием мишени действия препаратов.
М – устойчивость к 14-ти и 15-членным макролидам (сохранении чувствительности к 16-ти членным макролидам, линкозамидам и стрептограминам), обусловленная активным выведением АБП.
Фторхинолоны. Традиционные фторхинолоны (пефлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин и ломефлоксацин) не являются адекватными для лечения пневмококковых инфекций, соответственно оценивать чувствительность к этим препарата нецелесообразно. В последние годы в лечении пневмококковых инфекций важное место заняли антипневмококковые фторхинолоны (левофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин и гатифлоксацин). Частота устойчивости к перечисленным препаратам минимальна, однако поскольку между ними не наблюдают полной перекрестной резистентности возникает необходимость включения в исследование всей группы
АБП других групп. Из антибиотиков других групп, для лечения пневмококковых инфекций применяют ко-тримоксазол, хлорамфеникол, тетрациклины. Однако роль перечисленных препаратов в последние годы резко снижается в связи нарастанием устойчивости, меньшей клинической эффективностью в сравнении с бета-лактамами, макролидами и антипневмококковыми фторхинолонами, также значительным числом нежелательных эффектов.
Для лечения тяжелых пневмококковых инфекций, вызванных штаммами с высоким уровнем устойчивости к антибактериальным препаратам других групп в ряде случаев рекомендуется ванкомицин.
Критерии интерпретации результатов определения чувствительности S.pneumoniae (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 7.
Определение чувствительности Streptococcus spp. группа «viridans”.
Проводить определение чувствительности штаммов стрептококков группы “viridans”, выделенных из нестерильных локусов в рутинной практике нецелесообразно. У штаммов, выделенных из стерильных в норме локусов организма, необходимо, в первую очередь, исследовать чувствительность к пенициллину. Воспроизводимые результаты при определении чувствительности стрептококков группы “viridans” к пенициллину удается получить только при помощи метода серийных разведений, ДДМ не пригоден для этой цели.
Штаммы, чувствительные к этому антибиотику следует расценивать, как чувствительные ко всем бета-лактамным антибиотикам. Часть штаммов, устойчивых к пенициллину, могут сохранять чувствительность к некоторым цефалоспоринам III поколения (цефотаксиму и цефтриаксону), IV поколения (цефепиму) и карбапенемам. Однако критерии интерпретации результатов определения чувствительности в настоящее время установлены только для цефотаксима и цефтриаксона.
Определенный интерес может представлять изучение чувствительности стрептококков группы “viridans” к эритромицину и другим макролидам, клиндамицину, тетрациклину и хлорамфениколу, однако клиническое значение получаемых при этом данных не определено.
В случае сниженной чувствительности или резистентности зеленящих стрептококков к пенициллину при выдаче результатов тестирования клиницистам целесообразно рекомендовать проведение комбинированной терапии бета-лактамами с аминогликозидами, которые проявляют синергизм при совместном применении с бета-лактамами, несмотря на отсутствие у аминогликозидов собственной значимой активности в отношении стрептококков.
Определение чувствительности бета-гемолитических стрептококков.
К бета-гемолитическим стрептококкам относятся микроорганизмы, принадлежащие к различным серологическим группам по Лансфельд (А, B, C, G). Среди них наибольшее клиническое значение имеют стрептококки группы А (Streptococcus pyogenes) и группы В (Streptococcus agalactiae).
Препаратами выбора для лечения инфекций, вызванных бета-гемолитическими стрептококками являются бета-лактамы, причем достоверных случаев устойчивости к АБП этой группы не описано. Не описана и устойчивость к ванкомицину. Следовательно, оценивать чувствительность к указанным АБП в рутинной практике нецелесообразно.
При выделении из нестерильных локусов необходимость в оценке чувствительности возникает только для S. pyogenes и S. agalactiae. Примерный перечень препаратов для определения чувствительности этих микроорганизмов включает: макролиды (эритромицин) и линкосамиды (клиндамицин). С целью мониторинга антибиотикорезистентности возможно определение чувствительности к хлорамфениколу и левофлоксацину. Для бета-гемолитических стрептококков, выделенных из стерильных локусов необходимо определять чувствительность ко всем вышеперечисленным препаратам одновременно.
Примерный перечень АБП, рекомендуемых для определения чувствительности S.pneumoniae, стрептококков группы “viridans” и бета-гемолитических стрептококков, выделенных из различных локусов организма, представлен в таблице 18.
Критерии интерпретации результатов определения чувствительности
Streptococcus spp. (кроме S.pneumoniae) (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 8.
6.8. Определение чувствительности Haemophilus influenzae.
Питательные среды.
Для определения чувствительности Haemophilus spp. используют специальную питательную среду, например HTM, содержащую необходимые для гемофил факторы роста.
Эту среду можно приготовить в лаборатории на основе среды Мюллера-Хинтона:
- среду готовят на основе бульона или агара Мюллера-Хинтон. После растворения основы в нее добавляют дрожжевой экстракт (до конечной концентрации 5 мг/мл)
и раствор гематина (до конечной концентрации 15 мг/л). Для приготовления основного раствора гематина 50 мг порошка помещают в 100,0 мл 0,01N NaOH
(0.01 моль/л) и нагревают при тщательном перемешивании до полного растворения.
В подготовленную для автоклавирования среду на 1 л вносят 30,0 мл основного раствора гематина; - после автоклавирования и охлаждения основы до 48–500С в нее асептически вносят раствор никотинамид аденин динуклеотида (НАД) до конечной концентрации
15 мг/л. Раствор НАД стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры
с размером пор 0,45 мкм; - при определении чувствительности к сульфаниламидам и триметоприму
в охлажденную до 48 - 500С среду асептически вносят также раствор тимидин фосфорилазы до конечной концентрации 0,2 ед/мл.
Haemophilus spp. характеризуются природной чувствительностью к большинству распространенных антибиотиков, в том числе, и к бета-лактамам. Практически важным исключением является отсутствие активности в отношении Haemophilus spp. у цефалоспоринов I поколения. Наибольшее значение имеет приобретенная резистентность к ампициллину, обусловленная продукцией плазмидных бета-лактамаз ТЕМ-1 и ROB-1. Кроме ампициллина эти ферменты частично гидролизуют цефалоспорины I поколения, но не активны в отношении препаратов II - III поколений.
Известны штаммы H.influenzae, устойчивость которых к ампициллину связана с изменением мишени действия -лактамных антибиотиков (пенициллинсвязывающих белков) или снижением проницаемости наружной клеточной стенки. Эти штаммы получили название бета-лактамазонегативные ампициллинорезистентные (БЛНАР) и считаются нечувствительными к ингибиторозащищенным пенициллинам и таким цефалоспоринам, как цефаклор, цефуроксим, цефиксим, цефтибутен. До настоящего времени не получено клинических штаммов H.influenzae, устойчивых к цефалоспоринам III–IV поколений и карбапенемам.
Для выявления ампициллинорезистентности у гемофильной палочки в рутинной лабораторной практике достаточно определения чувствительности к ампициллину диско-диффузионным методом и теста на продукцию -лактамаз с нитроцефином.
Эти два теста позволяют подразделить штаммы на ампициллиночувствительные, бета-лактамазопродуцирующие ампициллинорезистентные (чувствительные к ингибиторозащищенным пенициллинам и цефалоспоринам II–IV поколений) и БЛНАР, которые следует расценивать как резистентные к ингибиторозащищенным пенициллинам и некоторым цефалоспоринам. Причем тестирование с диском, содержащим ингибиторозащищенные пенициллины, например амоксициллин/клавуланат, не позволяет отличить БЛНАР от ампициллиночувствительных штаммов H.influenzae.
Макролидные антибиотики, в целом, отличаются невысоким уровнем активности в отношении Haemophilus spp., при этом между ними выявляются незначительные различия (наибольшая активность характерна для азитромицина). Низкий уровень активности макролидов связан с наличием у этого микроорганизма фоновой активности механизмов активного выведения. Подавляющее большинство штаммов H. influenzae с микробиологической точки зрения относятся к «дикой» популяции, лишенной дополнительных детерминант резистентности к этим АБП. Однако in vivo при приеме в рекомендуемых дозах концентрации макролидов органах и тканях оказываются недостаточными для обеспечения эрадикации патогена. Учитывая приведенные факты обоснованность критериев чувствительности H. influenzae к азитромицину и кларитромицину вызывает сомнения.
Устойчивость к фторхинолонам среди H. influenzae встречается редко, однако частота встречаемости штаммов с повышенными значениями МПК фторхинолонов возрастает, что обосновывает необходимость тестирования указанных АБП. Наиболее вероятно, что между отдельными представителями этой группы существует перекрестная резистентность, характерная и для других грамотрицательных бактерий.
Примерный перечень АБП, рекомендуемых для определения чувствительности H.influenzae, выделенных из различных локусов организма, представлен в таблице 18.
Критерии интерпретации результатов определения чувствительности
H.influenzae (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 9
6.9. Определение чувствительности Neisseria gonorrhoeae.
Оценка антибиотикочувствительности N.gonorrhoeae представляет собой достаточно сложную методическую проблему. Методы определения чувствительности гонококков в бульоне недостаточно надежны, поэтому следует использовать только метод разведений в агаре или ДДМ.
Питательные среды.
Для определения чувствительности N.gonorrhoeae используют гонококковый агар, состоящий из гонококковой агаровой основы и комплексной питательной добавки следующего состава:
Глюкоза 100 г
L-цистеингидрохлорид 25,9 г
L-глютамин 10 г
L-цистин 1,1 г
Аденин 1 г
Никотинамидадениндинуклеотид 0,25 г
Витамин В12 0,1 г
Тиамина пирофосфат 0,1 г
Гуанина гидрохлорид 0,03 г
Fe(NO3)3.6H2O 0,02 г
Парааминобензойная кислота 0,013 г
Тиамина гидрохлорид 3 г
При тестировании карбапенемов и клавулановой кислоты необходимо использовать добавку, не содержащую цистеин.
Все ингредиенты растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и затем доводят объём до 1 л. КПД стерилизуют фильтрацией через бактериальный фильтр 0,02 мкм. КПД нельзя хранить и автоклавировать, необходимо использовать ex tempore. Полученную смесь асептически вносят в GC агар после автоклавирования и охлаждения до 48–50оС в количестве 1,0% (объем/объем). Агар разливают в чашки Петри без добавления антибиотиков для ДДМ и с добавлением АБП для метода разведения в агаре.
Средствами выбора для лечения гонореи являются бета-лактамные антибиотики. Однако, среди штаммов N. gonorrhoeae широко распространена резистентность к пенициллину, тетрациклинам и макролидам. В ряде регионов Земного шара отмечают резкое возрастание частоты резистентности гонококков к фторированным хинолонам. Для практики крайне важно то, что до сих пор достоверно не описано случаев резистентности гонококков к цефалоспоринам III поколения, что позволяют рассматривать цефалоспорины III поколения (цефотаксим и цефтриаксон) как препараты выбора для лечения гонореи.
Таким образом, на практике оценивать антибиотикочувствительность гонококков следует только в тех случаях, когда для лечения невозможно или нецелесообразно использовать цефалоспорины III поколения. Такие ситуации складываются при наличии у пациентов аллергии к бета-лактамам или при смешанных гонорейно-хламидийных инфекциях, а также для эпидемиологического мониторинга.
В набор для тестирования N.gonorrhoeae рекомендуется включать фторхинолоны (офлоксацин или ципрофлоксацин), тетрациклины, спектиномицин. Дополнительно для более полной характеристики штаммов и эпидемиологического мониторинга целесообразно изучать чувствительность к пенициллину и цефалоспоринам II-III поколений.
Критерии оценки антибиотикочувствительности Neisseria gonorrhoeae приведены в таблице 10.
